美丽文字壮骨关节丸
药物肝毒性是肝损伤和肝功能失常的常见病因，是药物从市场上撤出的主要原因之一[1]，已经有900多种药物被报道会引起肝毒性[2]，而药物的肝毒性可分为固有肝毒性和特异质肝毒性。随着中药在国际上的广泛使用、我国药品不良反应监测体系的不断完善以及民众对药品不良反应关注度的大幅提高，近年来中药不良反应报道呈显著增多之势[3]，特别是传统无毒中药的肝毒性问题屡有报道，引起人们对中药安全性的严重担忧。中国食品药品不良反应监测中心分别于2001、2008年通报了壮骨关节丸（Zhuangguguanjie Wan，ZGW）致肝损伤现象，ZGW[4]由熟地、补骨脂、淫羊藿、鸡血藤、独活、续断、狗脊、骨碎补、桑寄生、木香、乳香、没药共12味中药组成，从处方分析来看，增强免疫的补肝肾药占2/3，而抑制免疫的祛风湿、活血药较少，提示促进免疫的补肝肾药对于免疫异常活化的人群，可能会增加其肝损伤的风险。
课题组前期基于中药特异质肝损伤“免疫应激三因致毒”机制的观点[5-6]，利用脂多糖（LPS）介导的药物特异质肝损伤模型阐明了ZGW致肝损伤与何首乌诱导的特异质肝损伤一致[7-8]，并初步表明ZGW在机体免疫活化状态下，可促进T淋巴细胞募集至肝脏，导致细胞因子的过度表达和过度炎症反应，从而诱发药物特异质肝损伤[9]。近年来研究[10]发现细胞因子与肝损伤的发生、发展有密切关系，但是否与特异质肝损伤存在确切的相关性少有报道。本实验旨在寻找ZGW所致的特异质肝损伤与27种细胞因子的相关性，以期为ZGW的风险评估和合理用药提供新的思路和理论支撑。
1 材料
1.1 动物
SD大鼠，180～190 g，雄性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号为SCXK-（军）2012-0004。
1.2 药物与试剂
ZGW（批号1512007S，华润三九医药股份有限公司）；LPS（批号046M4045V，Sigma公司）；水合氯醛（批号20150923，宇龙海藻有限公司）；蛋白酶抑制剂Cocktail I、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白裂解液、Milliplex蛋白芯片试剂盒（美国默克化工技术有限公司）。
1.3 仪器
Luminex 200蛋白芯片多功能液相芯片分析仪、Milliplex多功能液相芯片分析平台（美国默克化工技术有限公司）；MettlerToledo AL204分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Neofuge 1600R低温台式高速离心机（上海力申科学仪器有限公司）。
2 方法
2.1 动物模型制备及给药
实验前将SD大鼠（46只）禁食12 h，根据前期实验基础[9]，ig给予ZGW 3.8 g/kg（羧甲基纤维素钠配制），2 h后尾iv LPS 2.8mg/kg。10 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，麻醉剂量为3 mL/kg，腹主动脉取血，低温离心（4 ℃、3 500 r/min）10 min，取上清。取血后，立即剪取大鼠肝脏组织，放入?80 ℃冰箱冻存，备用。
2.2 检测指标
2.2.1 肝功能指标 利用全自动生化分析仪，按照说明书检测大鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）活力。
2.2.2 肝脏组织细胞因子检测 将肝组织从?80 ℃冰箱中取出，冰上操作，剪取一定质量肝组织，加入含蛋白抑制剂的裂解液，利用高速粉碎机粉碎为匀浆液，4 ℃、15 000 r/min，离心20 min，取上清。按照BCA试剂盒说明书进行蛋白定量并进行蛋白调平，采用Milliplex蛋白芯片试剂盒对大鼠肝组织裂解液中的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-1α（IL-1α）、IL-1β、瘦素（leptin）、巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP-lα）、IL-4、IL-2、IL-6、表皮细胞生长因子（EGF）、IL-13、IL-10、IL-12p70、γ干扰素（IFN-γ）、IL-5、IL-17A、IL-18、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、趋化因子-10（IP-10）、嗜中性趋化因子（GRO/KC）、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES）、CX3CL1趋化因子（fractalkine）、脂多糖诱导的cxc趋化因子（LIX）、巨噬细胞炎性蛋白-2（MIP-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）27种细胞因子进行检测。
2.3 分析方法及软件
以“2.2”项下检测的所有样本27种肝脏细胞因子及ALT活性为数据来源（数据中主要包括计量资料），根据其分布特征进行描述统计分析。正态分布连续变量用均值、标准差表示，两组比较采用t检验；非正态分布连续变量或等级（有序）变量用中位数（下四分位数、上四分位数）描述，组间比较采用Willcoxon秩和检验；利用Shapiro-Wilk检验是否服从正态分布，取显著水平为0.01。同时，给出所有指标的分布图、相关系数图、相关系数检验、基于聚类算法产生的相关矩阵图，所有分析运用R 3.2.4软件实现。
3 结果
3.1 全组数据统计描述
对27种肝脏细胞因子和肝功能ALT指标进行描述统计。各指标数据量纲差异很大，均值、标准差、中位数等相差较大，例如EGF均值/标准差较小，仅1.31/0.34，而IL-6的均值/标准差高达4 252.76/664.50，结果见表1。
3.2 各指标之间的相关系数
对数据进行标度转换，利用标准差除以原始数据得到新数据，再对各指标之间的相关性进行分析，明确各指标间的相关性，特别是它们与ALT的相关性。结果显示，多组细胞因子的相关系数较高，相关系数大于0.80的细胞因子组有IL-1α/IL-1β（0.86）、GM-CSF/IL-13（0.88）、GM-CSF/MIP-2（0.86）、IL-2/IL-12p70（0.88）、IL-2/IL-17A（0.92）、IL-2/fractlkine（0.88）、IL-2/TNF-α（0.84）、IL-6/TNF-α（0.87）、IL-13/GM-CSF（0.88）、IL-13/MIP-2（0.87）、IL-10/GRO/KC（0.84）、IL-10/LIX（0.86）、IL-10/leptin（0.80）等，表明这些细胞因子之间相关性较强。结果见表2。
3.3 各指标分布图及其相关系数图
各指标的分布图及它们之间的相关系数图见图1。通过对相关系数矩阵的可视化查看所有指标之间的相关性。变量的顺序是基于聚类算法产生的（按照8大类指标划分），结果显示一些指标之间具有较强相关性。如ALT、MIP-1α和VEGF之间具有较强的正相关性；IL-18、IP-10、IL-1α和IL-1β之间具有很强的相关性；Eotaxin或RANTES各自具有独立性。每项指标之间具体的相关系数及其检验结果见图2。
通过统计检验，具有显著强相关性（显著水平＜0.001）的指标关系见表3（按照Pearson系数和显著性水平排序）。同时，考虑成对细胞因子的相关性的绝对值，如果2个变量有1个高的相关性，则考虑每个变量的平均绝对相关性，并移除具有此最大值的变量。除ALT外，相关系数大于0.75的细胞因子组共27组，包括IL-2/IL-17（0.917）、IL-2/fractalkine（0.883）、IL-2/IL-12（0.881）、IL-12/IL-17（0.876）、GM-CSF/IL-13（0.875）、IL-6/TNF-α（0.869）、fractalkine/TNF-α（0.867）、IL-13/MIP-2（0.865）等。
4 讨论
药物特异质肝损伤分免疫特异质和代谢特异质2种类型，前者与机体的免疫应激状态有关[11-12]。细胞因子是由免疫细胞（如单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和一些非免疫细胞（如血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等）经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质[13]。免疫细胞及其分泌的细胞因子在免疫特异质肝损伤过程中起到重要作用，淋巴细胞产生的促炎性细胞因子及抗炎性的细胞因子发挥着相互调节和制约的作用，维持机体正常稳定的免疫状态，但是当某些致病因素通过各种途径造成这些细胞因子相互调节和相互制约的作用失去原有的平衡时，则会引起炎症性的疾病和自身免疫性疾病的发生[14]。ZGW致肝损伤为免疫特异质肝损伤，为了解与ZGW所致肝损伤相关细胞因子，本研究检测了27种细胞因子，并通过数据挖掘的方法对其相互之间的相关性及与ZGW特异质肝损伤的相关性进行分析。
本研究所选细胞因子涉及面较广，包括生长因
子类（G-CSF、GM-CSF、EGF、VEGF）、白细胞介素类（IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IL-18）、趋化因子类（eotaxin、IP-10、MCP-1、RANTES、GRO/KC、fractalkine、LIX）、炎性介质类（MIP-1α、MIP-2、TNF-α、IFN-γ、leptin）。这些细胞因子由多种免疫细胞分泌，参与肝损伤的发生发展过程。Th1细胞分泌的IL-2、L-12、TNF-α和IFN-γ等促炎细胞因子主要与促进免疫炎症反应有关[15]，其含量与肝脏的炎症程度呈正相关；Th2细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等抗炎细胞因子主要参与体液免疫应答，刺激B细胞增殖产生抗体，对肝脏的损伤具有保护作用；Th17细胞分泌的IL-17是一种在多种炎症性疾病中可检测到增高的新型免疫调节因子[16]，在自身免疫性肝炎患者的肝脏组织中，其表达强度与肝脏纤维化程度呈正相关；多种免疫细胞均可产生的IL-1[17]、eotaxin[18]、IP-10[19]、MCP-1[20]、MIP-1α[21]、MIP-2、G-CSF[22]、GM-CSF[23]等细胞因子，参与机体免疫调节的一系列过程；由脂肪组织分泌的leptin[24]，主要调节机体固有免疫和适应性免疫的平衡。
为了构建上述细胞因子与肝损伤之间的关系，首先对27种细胞因子以及肝功能指标ALT进行描述统计，给出各个指标的均值、标准差、最值、中位数、上下四分位数、偏度、峰度等统计量，并通过各指标之间相关系数、分布图及其相关系数图，量化并可视化指标之间的关系。由于各指标数据量纲差异很大，本研究对数据进行了标度转换，利用标准差除以原始数据得到新数据，再对各指标之间的相关性进行分析，明确各指标间的相关性，特别是肝脏各细胞因子与ALT之间的相关性。
本研究结果显示，ALT与MIP-1α和VEGF之间具有较强的正相关性，相关系数分别为0.54和0.56。有研究表明，非酒精性脂肪肝患者血清中VEGF水平显著增高[25]，MIP-1α在刀豆蛋白A诱导的肝损伤模型中显著升高[26]。说明MIP-1α和VEGF与ZGW特异质肝损伤具有相关性，可为ZGW的临床合理用药和诊断提供参考。有文献报道细胞因子间可相互影响，Malefyt等[27]发现内源性和外源性IL-10均可显著抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF和G-CSF的合成，从而发挥抗炎的作用。在刀豆蛋白A诱导的肝损伤模型中，IL-4可通过介导信号转导和转录激活蛋白6依赖途径诱导趋化因子和IL-5的表达，继而嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞被募集到肝脏，最终导致肝损伤[28]。本研究结果表明IL-18、IP-10、IL-1α和IL-1β之间具有很强的相关性，并通过统计发现152对具有显著相关性的细胞因子，除ALT外，相关系数大于0.75的细胞因子组共27组，包括IL-2/IL-17（0.917）、IL-2/fractalkine（0.883）、IL-2/IL-12（0.881）、IL-12/IL-17（0.876）、GM-CSF/IL-13（0.875）、IL-6/TNF-α（0.869）、fractalkine/TNF-α（0.867）、IL-13/MIP-2（0.865）等。说明ZGW特异质肝损伤相关细胞因子之间互相交叉，形成调节网络，一旦其中1个发生变化，可能形成连锁反应，但具体的机制尚不清晰，还有待进一步的研究。
综上所述，本研究综合分析了ZGW特异质肝损伤与27种细胞因子的相关性及27种细胞因子之间的相关性，所得结论对ZGW的临床合理应用具有一定的参考价值和指导意义。
参考文献（略）
来 源：唐进法，王晓艳，李伟霞，李宇辉，王伽伯，柏兆方，肖小河，杨 伟，基于相关可视化的壮骨关节丸特异质肝损伤与27种细胞因子的相关性分析 [J]. 中草药, 2018, 49(7):1624-1633.
